磁珠提纯 DNA,说白了就是给 DNA 穿上个“过滤器”,然后甩掉所有杂质。你见过磁铁吸起铁屑,那玩意儿也吸附了 DNA,但得先让 DNA 自己乖乖听话,呆在磁性小球上。
要是直接扔进溶液里,磁珠是吸不动的。你得先加个表面活性剂,把 DNA 洗出来,再加热让它膨胀,这时候 DNA 就变成胶状了,磁性微胶囊包住了它,这时候磁铁一碰, DNA 瞬间被吸上来。
要是直接吸,洗的时候还得花半天把洗下来的洗液冲干净利落,忒费事了。
故此第一步,你得配个含表面活性剂的溶液。 这溶液里得加点乙醇,比如 2% 的 96% 乙醇。乙醇的功能是帮表面活性剂把 DNA 从水里拉出来,形成胶束。
不过乙醇浓度不能忒高,否则 DNA 自己也会沉淀,反而被洗下来了。得管住在 0.1 到 2% 之间。
这个比例得慢慢调,忒稀吸附力不够,忒稠了 DNA 好办 stuck 住,洗的时候脱不掉。 接下来加热是个关键步骤。要把磁珠放在水里,烧个三到五分钟。
这时候 DNA 会膨胀,从双螺旋变成单链,然后核酸酶会启动干活,它们会像偷一样把 DNA 切成小段,最终切成几段几段的片段。
这个过程叫降解,是个坏事,但也是好事,出于 DNA 变短了,更好办被洗掉。
不过你得管住工夫,别烧忒久,不然 DNA 全烂没了,得赶紧停火,然后用酶要么离心把 DNA 洗下来。 洗的时候,得用高浓度的盐水,比如 0.15M NaCl。盐的功能是补位,让 DNA 恢复双螺旋结构,顺便把那些穿帮的杂质给挤出来。盐浓度得够高,不然 DNA 跑不掉,杂质也排不出去。
这一步得反复几次,每次洗都加盐水,加上乙醇,再加盐水,直到洗出来的液子里 DNA 没带出来为止。 溶解后再上磁,得确保 DNA 是单链状态,不然双链的 DNA 上还有连着亲水基团的负电荷,磁珠吸不住。
这时候得加个 EDTA,把金属离子“赶”走,不然那些金属离子会干扰 DNA 的双螺旋结构。加完 EDTA,再上磁珠,磁力一吸,DNA 就乖乖粘在磁珠上了。
这时候得小心操作,别把磁珠甩飞了,不然吸附的 DNA 就散架了。 洗的时候,用的盐浓度得比上次高,毕竟盐浓度越高,杂质越好办被洗掉。
一般洗三次,每次加盐水后都要离心,把洗下来的穿帮物甩出来。
这次洗的盐浓度要够猛,把洗下来的杂质也一并洗掉。洗完之后,再用乙醇处理一下,乙醇浓度得高,比如 20% 到 60%,让 DNA 重新沉淀下来。
这时候得把沉淀下来的 DNA 和洗下来的杂质分清楚,出于杂质有时候也会沉淀,混了再溶解也不好办。
故此离心得干干净利落净,把沉淀漂洗掉。 最终一步是跑个 agarose gel 看效果。把洗出来的 DNA 溶液上胶,加个合适的熔解液,比如 TAE 或 TBE。
这时候看胶,应当有一条挺亮的大带,旁边可能还有一条细一点的杂带。
要是杂带忒亮,说明没洗干净利落,得再加几个循环。
要是大带挺淡,说明 DNA 没洗干净利落要么浓度忒低。
这时候还得看样品浓度,要是浓度不够,可能 DNA 还是没洗出来,要么洗的时候流失了。 实际操作中,不同仪器条件不一样,高浓度盐洗得更彻底,低浓度盐洗得慢。还得注意温度,水浴锅的温度要合适,忒高了 DNA 好办变性,忒低了洗不干净利落。
有时候光靠洗不够,还得加个二甲基甲酰胺要么异硫氰酸胍,它们能把那些顽固的杂质彻底勾出来。勾出来的杂质再离心,就能拿到纯度挺高的 DNA 溶液。 整个过程别看步骤多,但核心就两点:一是把 DNA 吸附在磁珠上,二是把杂质彻底洗掉。吸附靠磁场和化学试剂,洗脱靠高浓度盐。
只要管住好每个环节,比如洗盐浓度、加热工夫和乙醇比例,就能拿到挺干净利落的结局。 另外,磁珠表面的电荷也挺关键。磁性微胶囊表面有负电荷,DNA 也是带负电的,这样静电引力才能把它们吸到一起。
要是表面电荷不够,DNA 就跑不下来。
这时候能够加个带正电荷的试剂,中和一下电荷,让 DNA 更好办吸附。
不过加多了又可能把杂质也吸附上,故此得找平衡点。 还有,磁珠的大小也得合适。忒小吸附力不够,忒大好办洗不净。
一般买的时候看包装说明书,要么看厂家推荐。
要是是实验室自制,得根据实验目标调整。
比如做 PCR,洗盐浓度要高一点;做测序,洗盐浓度低一点,出于测序仪对杂质没那么敏感。 最终,实验过程中要有耐心。洗的时候别忒急,离心力大了可能把洗下来的 DNA 也甩出来。洗的时候加盐,要慢慢加,让溶液慢慢变浑浊,这样杂质才能被挤出来。
有时候洗一次不够,得再加热要么加个变性剂,把洗不掉的杂质再挖出来。 总而言之,磁珠提纯 DNA 是个系统工程,不是哪一步做坏了就行。每一步都得盯着,看效果。洗不干净利落,跑胶看,再调整参数。
这样一步步来,就能把 DNA 提得干干净利落净。